冷冻过程中缓冲盐结晶导致pH变化

对于冻干和冷冻制剂**，在冷冻浓缩过程中缓冲成分的结晶倾向成为一个重要的考虑因素，在冷冻过程中缓冲成分的选择性结晶可能导致pH值的变化，从而影响蛋白质的稳定性。磷酸盐缓冲液是一种被**研究的例子，其中十二水磷酸二钠（磷酸盐缓冲液的基本成分）在冷冻过程中降低了冷冻浓缩液的pH值，并可能改变蛋白质的稳定性。

缓冲液的结晶行为和冻结过程中相关的pH值变化取决于几个因素，包括缓冲液的类型和浓度、初始溶液pH和其他配方成分的浓度。

下图显示了不同缓冲液在冻结时的pH值变化，按初始pH值的递增顺序(从左到右)绘制。左图为缓冲液pH偏移＞1单位，右图为缓冲液pH偏移≤1单位。填充的圆圈表示每种缓冲溶液在室温25℃时的初始pH值。箭头指向冻结过程中pH值变化的方向，箭头的**表示将溶液冻结至-25℃后的*终pH值。

 

从图中可以观察到不同因素对缓冲液冻结过程中pH值变化的影响。

 

（1）初始pH值：柠檬酸盐缓冲液对初始pH为5.0或6.0的溶液效果良好，但当初始pH为4.0时，pH值会发生~+2个单位的变化（浅橘红色，左图**个柱子及右图两个同色柱子）。同样，组氨酸缓冲液在pH为5.5时显示+2个单位的pH位移，而在pH为6.0和7.0时则没有（深绿色，左图第四个柱子及右图两个同色柱子）。

 

（2）缓冲液浓度：缓冲液的浓度对pH值变化的幅度和性质都有**的影响。例如，初始pH值为7.2的磷酸盐缓冲液，浓度为100 mM时，*终冻结后pH值为2.8，浓度为10 mM时，*终冻结后pH值为4.1（左图*右侧两个柱子）。

 

（3）与其他溶质的相互作用：制剂**中的其他溶质和缓冲液组分的相互作用可能会影响彼此的结晶倾向。了解共溶质对缓冲液结晶的影响是很重要的，因为这将影响冷冻浓缩液的pH，从而影响蛋白质的稳定性。

例如，当含有磷酸盐缓冲液(10或100 mM)和甘氨酸(0.8% w/v)的溶液被冷冻时，这两种组分都更易结晶。虽然这并不影响甘氨酸作为冻干赋形剂的功能，但缓冲盐的明显结晶导致冻结时pH值发生变化。

 

有趣的是，0.8% w/v浓度甘氨酸的存在增加了10mM和100mM磷酸盐缓冲液在冷冻时的pH值变化幅度。而在低浓度(0.4% w/v)下，甘氨酸反而会抑制磷酸盐缓冲液在冷冻时的pH值变化。然而，在如此低的浓度下，甘氨酸可能无法发挥冻干赋形剂的作用。因此，需要明智地选择配方成分及其浓度，以确保各个组分的功能，从而获得稳定的冻干制剂**。

 

同样，磷酸盐缓冲液也能抑制甘露醇结晶。下图展示了缓冲液浓度对甘露醇和甘氨酸在*终冷冻产品中结晶情况的影响，溶液中甘露醇和甘氨酸含量为5% w/w。当甘露醇和甘氨酸混合使用时，磷酸盐缓冲盐在冷冻溶液中**抑制这两种溶质的结晶，磷酸盐缓冲液浓度的增加（50mM~200mM）降低了甘露醇和甘氨酸的结晶度。

甘露醇和甘氨酸的结晶度降低，可以转化为更高的蛋白酶活性保留。下图为冷冻干燥后辅料结晶对乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响。上半部分为蛋白酶活性与缓冲液浓度的关系（配方中甘露醇和甘氨酸各占5% w/w），可见随着缓冲液浓度升高，冻干后保留的蛋白酶活性升高。下半部分为*终产品中的结晶甘露醇和甘氨酸馏分。随着缓冲液浓度升高，冻干产物中甘露醇和甘氨酸的结晶度降低。

一般来说，只有无定形的溶质才能抑制缓冲液的结晶。然而，当共溶质结晶时，也观察到缓冲结晶。

 

艾伟拓成立20年来，始终专注**注射级辅料，长期稳定供应注射级海藻糖、蔗糖、TRIS/TRIS-HCl、HEPES等生物制剂辅料，具有GMP条件生产，中美双报，**内**，DNase& RNase free，符合国际主流药典标准，现货快速供应等优势，助力mRNA疫苗、抗体药物，腺病毒载体制剂等**生物制剂的研发生产与中外申报！